МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ПРОБИОТИКОВ НА СИМБИОНТНОЕ ПИЩЕВАРЕНИЕ ("ИЗВЕСТИЯ РАН" СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ), 2015

МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ПРОБИОТИКОВ НА СИМБИОНТНОЕ ПИЩЕВАРЕНИЕ

 

© 2015 г. Н. А. Ушакова(1),

Р. В. Некрасов(2), И. В. Правдин(3),
Н. В. Сверчкова(4), Э. И. Коломиец(4),

Д. С. Павлов(1)

(1)Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33
(2)Всероссийский научно+исследовательский институт животноводства им. академика Л.К. Эрнста,
142132 Московская обл., Подольский р+н, пос. Дубровицы, 60

3) Научно+технический центр биотехнологий в сельском хозяйстве, 309292 Белгородская обл.,

г. Шебекино, ул. Докучаева, 2
(4) Институт микробиологии НАН Беларуси, 20141 Беларусь, Минск, ул. Купревича, 2

 

ассмотрены и обобщены литературные и собственные данные о механизмах влияния микроорганизмов,пробиотиков, пребиотиков и их сочетаний на процессы симбионтного пищеварения. Отмечено, что эффекты воздействия на организм связаны с повышением метаболической активности
бактерий кишечника: стимуляцией бактериальной ферментации углеводов и образования короткоцепочечных жирных кислот, повышением всасывающей способности кишечника за счет увеличения длины ворсинок и глубины крипт, снижением выделения токсичных продуктов протеолиза
(аммиак, фенолы, тиолы, индолы и др.). Показано, что комбинация пробиотиков и пребиотиков
обеспечивает усиление биологической эффективности комплексного препарата, что способствует
активизации углеводного, белкового, минерального обменов веществ.

Развитие  фундаментальных  исследований симбиотических взаимодействий организма и его
микробиоты получило новое направление в связи с появлением представлений о механизмах

влияния бактерий, пробиотиков на процессы симбионтного пищеварения. Биологически актив-
ные добавки, содержащие живые микробныекультуры, оказывают благоприятное действие на
организм человека и животного, улучшая кишечный микробный баланс, стимулируя обменные и
иммунные процессы. Кишечный микробиоценоз –это высокоорганизованная динамическая система, которая реагирует определенными качественными и количественными сдвигами на изме-

нения состояния организма (Шендеров, Манвелова, 1997; Шендеров 1998; Гриневичи др., 2008).
Сложившееся в онтогенезе бактериальное сообщество желудочно-кишечного тракта и его метаболическая активность играют важнейшую роль вподдержании здоровья и нормальной жизнедеятельности организма хозяина. При этом одна из основных функций микробной экосистемы

кишечника связана с пищеварением.

Цель работы – обобщение литературных и собственных данных по симбионтному пищеварению

и оценке факторов, влияющих на его эффективность.

 

В современной литературе выделяют три типа пищеварения: собственное, аутолитическое и
симбионтное (Чернин и др., 2013б). Собственное (ферментативное) пищеварение осуществляется собственными ферментами организма и в основном завершается в тонком кишечнике, где активно всасываются пищевые вещества. Аутолитическое пищеварение проис-ходит за счет ферментовпищевых продуктов, главным образом на начальных этапах онтогенеза, когда у молодого организма еще не развито собственное пищеварение. У млекопитающих в

этом процессе участвуют гидролитические ферменты молока матери; у некоторых видов живот-ных отмечено отрыгивание родителями полупереваренной пищи детенышам (хищники, некото-рые птицы). Симбионтное пищеварение связано с метаболической активностью симбионтных микроорганизмов и дополняет ферментативное пищеварение, повышая общую эффективность переваривания и усвоенияпищевых субстратов.

 

Соотношение собственного и симбионтного пищеварения зависит от типа питания. У растительноядных животных симбионтное пищеварение играет более важную роль и связано с морфологическими преобразованиями пищеварительной системы – особенностями строения желудка
и толстого отдела кишечника, степенью развитости слепой кишки (Наумова, 1981). В частности, у
жвачных в рубцовом отделе сложного желудка с помощью симбионтов – бактерий и простейших

–переваривается до 95% сахаров и крахмала, а также 55–60% клетчатки корма. 

(Курилов и др., 1968).
У нежвачных животных (с однокамерным желудком) основные процессы симбионтного пищеварения происходят в толстом отделе кишечника. В этом же отделе кишечника жвачных происходит
остаточное пищеварение целлюлозы и растительных белков, поскольку в толстой кишке практически отсутствует собственное пищеварение.
(Чернин и др., 2013а)
 

 

Основные продукты ферментации углеводов кишечными бактериями – короткоцепочечные жир-

ные кислоты (ацетат, пропионат, бутират) (Topping, Clifton, 2001) . Большинство образованных ве-ществ всасывается и метаболизируется, а также используется хозяином как апас энергии. 

 

Пропионаты транспортируются в печень в процессе глюконеогенезиса, ацетат – в различные тка-

ни, а также используются как топливо. Бутираты в основном окисляются кишечным эпителием. Считается, что при увеличении образования продуктов ферментации углеводов создаются более кислые условия (Scheppach et al ., 2001), что повышает олонизационную резистентность против патогенов, уменьшает образование вторичных желчных кислот, снижает активность специфичес-

ких ферментов, например протеаз (Macfarlane et al ., 1988; Topping et al ., 2003; Zampaet al., 2004). 

 

Другая важная функция продуктов ферментации углеводов – влияние на физиологию кишечника путем воздействия на трофику кишечного эпителия. Все три доминирующих метаболита (ацетат, пропионат, бутират) стимулируют пролиферацию и дифференциацию клеток различных отделов кишечного тракта (Frankelet al ., 1994) . Кроме того, показано, что эти вещества обладают gротивовоспалительными свойствами, влияют на активность гормонов (Hamer,et al. , 2008).
Хотя конечные продукты бактериального метаболизма необходимы организму хозяина, некоторые продукты протеолиза потенциально токсичны. Протеолиз происходит в основном в дистальной  

части  кишечника,  где  снижена концентрация доступных субстратов и отмечено нейтральное значение рН (Macfarlane et al. , 1992). Анаэробным расщеплением пептидов кишечными бактериями обуславливаются не только образование полезных для хозяина метаболитов (в частности, коротко-цепочечных и разветвленных жирных кислот – изобутирата, метилбутирата, изовалериата), но и выделение серии потенциально токсичных субстанций, включающих в себя аммиак, амины, фено-

лы, тиолы и индолы (Rastall, 2004) . Одни метаболиты повторно используются как источник азота

для бактериального роста, в то время как другие поступают в колоноциты и транспортируются в кровь. Продукты расщепления ароматических аминокислот тирозина и триптофана (фенолы и индолы) нейтрализуются в печени и выводятся с мочой. Интенсивность вторичного бактериально-

го использованиятаких азотсодержащих метаболитов влияет на общий азотный обмен в орга-

низме.
 

БАКТЕРИАЛЬНОЕ СООБЩЕСТВО ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА И ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЕГО СОСТАВ И МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

На композицию и особенности метаболизма кишечной микробиоты влияют различные факторы: доступность, разнообразие, состав и физико-химические свойства поступающих питательных веществ, продолжительность нахождения в кишечнике, рН химуса, возраст хозяина, состояние локального иммунитета, индивидуальные стратегии бактериальной ферментации, специфика выделенных бактериальных метаболитов (Gibson, Roberfroid, 1995; Meimandipour  et al .,2009; Парфенов, Бондаренко, 2012) . Предположено, что наиболее важную роль в регуляции метабо-лизма кишечного бактериального сообщества играет доступность питательных веществ.

 

В частности, соотношением доступных углеводов к азоту определяется интенсивность сахаро-литической ферментации по отношению к протеолитической (Priebe et al. , 2002) . Питательные компоненты подвергаются воздействию эндогенных ферментов в верхней части пищеваритель-ной системы, но основное ферментативное пищеварение происходит в желудке. В толстый кишечник поступают пищевые углеводы (остаточные крахмалы, пищевые волокна, олигосаха-риды, клеточные стенки растений), протеин, остаточные жиры, общий состав и количество ко-торых зависят от метаболической энергии и всасывания субстратов организмом хозяина, ко-торыми определяется запас энергии и питательных веществ для роста и развития кишечных бактерий.

 

В целом в проксимальном отделе толстой кишки субстраты доступны в изобилии. Микробиота

в первую очередь ферментирует углеводы, так как энергетически процесс получения АТФ из
углеводов предпочтительнее, чем из протеинов (Van Loo, 2004) . Как следствие, сахаролити-

ческие виды бактерий преобладают в этом отделе кишечника. По мере продвижения пищи по кишечнику отношение доступных углеводов к азоту уменьшается и в бактериальной компози-

ции начинают преобладать протеолитические, метаногенные и сальфатредуцирующие виды(Macfarlane 1992). 

Поскольку процесс пищеварения связан не только с положительным эффектом ферментации угле-водов, но и с образованием потенциально токсических продуктов бактериального расщепления протеинов, большинство разработок кормовых рационов для животных связано с повышением сахаролитической активности кишечника и снижением протеолиза. Один из наиболее специфи-ческих способов воздействия – сдвиг баланса кишечной микробиоты с помощью определенных пищевых факторов в целях ингибирования вредных или патогенных видов бактерий и обеспече-

ния преимущественного развития видов бактерий, полезных для хозяина. Для этого используются пробиотики – живые бактерии, оказывающие положительное влияние на организм хозяина.

 

К числу видов пробиотических бактерий, применяемых для животных, относятся представители родов  Bacillus (наиболее часто используются  B. subtilis и  B. licheniformis ),  Streptococ+ cus

( S. faecium ),  Lactobacillus ( L. acidophilus , L. plantarum , L. helveticum ),  Bifidobacterium ( B. glo+

bosum ). Альтернативная стратегия – влияние на кишечную микробиоту хозяина с помощью пребиотиков (пищевых компонентов, не гидролизуемых пищеварительными ферментами в желудке

и положительно влияющих на организм хозяина путем селективной стимуляции роста и/или активности одного или нескольких видов полезных бактерий кишечника) (Gibson  et al ., 2004) .  

 

К пребиотикам относят фруктозоолигосахариды, инулин, галактоолигосахариды, лактулозу, пище-

вые волокна . Большое внимание в последнее время уделяется пектинам, а также хитину и его производному – хитозану. 

 

Пре- и пробиотики, а также их композиции оказывают влияние на рост и метаболическую актив-ность кишечной микробиоты, ее состав и функции (Campbell et al. , 1997; De Preter  et al .,
2011; Ушакова и др., 2012, 2013а, б) . Одно из развивающихся направлений коррекции микробиоты связано с использованием синбиотиков (комплексные препараты, состоящие из пробиотиков
и пребиотиков). Такие комбинации обеспечивают выживание и имплантацию живых пробиотичес-ких бактерий в кишечном тракте животного и усиление их биологической активности с помощью пребиотиков.


Эффективность действия пробиотиков и пребиотиков оценивается по образованию короткоце-почечных жирных кислот как маркеров активности сахаролитической ферментации. Интенсив-

ность образования этих метаболитов служитиндикатором положительной бактериальной активности (Sakata  et al., 2003; Hernot  et al ., 2009) .


Пробиотики, пребиотики стимулируют образование короткоцепочечных жирных кислот, что свидетельствует о повышении бактериальной активности кишечника, и связанным с этим лучшим
использованием азота бактериальной массой химуса кишечника.

 

Считается, что пробиотики способны оказывать непрямое воздействие на бактериальную фер-ментацию углеводов и протеинов посредством стимуляции тех видов кишечной микробиоты, которые преимущественно ферментируют углеводы. Эксперименты, проведенные на крысах, свиньях, цыплятах и собаках, показали, что общая концентрация короткоцепочечных жирных

кислот или концентрация бутирата возрастают в кишечном содержимом или фекалиях при 

введении в корма пребиотиков (Heijnen ,  Beynen, 1997; Flickinger  et al ., 2003; Propst et al ., 2003;

Rehman et al. , 2008; Van Craeyveld et al ., 2008), компонентов клеточных стенок, растительных

фруктанов и даже неочищенных фитобиотиков (Demigne  et al ., 2008) . Эффективность применения в рационе молодых свиней комплексного синбиотического препарата "Простор", включающего в себя пробиотики (штаммы  B. Subtilis ) ,  пребиотики (пектины свекловичного жома, клеточные стенки дрожжей) и неочищенные порошки лекарственных растений (травы эхинацеи пурпурной и плодов расторопши пятнистой), продемонстрирова на в опытах по кормлению поро-

сят (Nekrasov et al ., 2014) .  При этом наблюдаемое у поросят увеличение живой массы тела соп-ровождалось интенсификацией пищеварения, увеличением числа клеток эпителия и общей пло-щади их цитоплазмы  в  тонком  отделе  кишечника,  где происходят основные процессы всасыва-ния, увеличение размеров ворсинок. Этим подтверждается высказанное предположение о том,

что продукты ферментации углеводов стимулируют пролиферацию и дифференциацию клеток ки-
шечного эпителия (Frankel  et al ., 1994) . Пробиотические препараты стимулируют развитие кишеч-ных бактерий, что ведет к включению азота (из аммиака и других источников) в белок бактериаль-ных клеток, уменьшая выделение аммиака с мочой. Также показано, что и пребиотики способны снижать в выделениях концентрацию аммония (Flickinger  et al ., 2003; Rehman et al.,2008).

 

При этом влияние пребиотиков на аммоний-азотный метаболизм в кишечнике связано с перераспределением поступления азота не в мочу, а в фекалии (Heijnen ,  Beynen, 1997), что объясня-
ется возрастанием синтеза бактериального протеина и уменьшением всасывания в кишечнике
азота, образованного из аммония. Такое влияние про- и пребиотиков косвенно проявляется в
уменьшении неприятного аммиачного запаха на животноводческих фермах и птицеводческих

хозяйствах и имеет положительное экологическое значение.


Дополнительной информацией о влиянии пищевых компонентов на модификацию кишечной
микробиоты являются сведения о бактериальной ферментативной активности в кишечнике на
примере гидролиза гликозидных связей. К гликозидазам относятся  β-глюкозидаза и  β-глюкуронидаза, которые расщепляют гликозидные связи с образованием агликанов, многие из которых

обладают канцерогенными свойствами (Goldin,1990).

 

В ряде исследований показано, что пре- и пробиотики существенно снижают  β-глюкуронидазную активность в фекалиях мини-свиней (Haberer  et al ., 2003). Желчные кислоты – это натуральные детергенты, которые эмульгируют липиды и жирорастворимые витамины, что обеспечивает

их использование организмом. В печени из холестерина синтезируются первичные желчные кислоты, из которых образуются желчные соли, поступающие в процессе пищеварения в тонкий кишечник, где они активно всасываются. Приблизительно 5% желчных солей поступает в толстый

кишечник и подвергается бактериальной трансформации путем деконъюгации с последующими
ферментативными преобразованиями. Наиболее важное из них – дегидроксилирование 7α-де-

гидроксилазой с образованием вторичных желчных кислот (дезоксихолевой и литохолевой)

(McGarret al ., 2005). Вторичные желчные кислоты могут провоцировать канцерогенез (Pearson

et al ., 2009). Имеются сведения о влиянии пре- и пробиотиков на метаболизм желчных кислот.

В опытах in vitro показано ингибирование бактериального образования вторичных желчных кислот при добавлении пребиотиков. Добавление к фекальной микробиоте лактобацилл и бифидо-бактерий снижало скорость такой конверсии желчных кислот. Схожий эффект был получен в опытах in vivo на крысах при добавлении в их рацион пребиотиков. При этом наблюдалось ингибирование процесса дегидроксилирования первичных желчных кислот (Andrieux  et al ., 1989).

 

Исследования на животных показали положительное влияние про- и пребиотиков на всасывание минералов. При этом возрастало потребление таких минералов, как кальций, магний (Demigne  

et al ., 2008; Wang  et al ., 2010). Существует несколько объяснений данному явлению. Возможно,

при интенсификации развития бактерий в кишечнике под влиянием пре- и/или пробиотиков происходит снижение рН химуса, что вызывает увеличение растворимости минералов. Также в экспериментах показано, что добавление как пробиотиков, так и пребиотиков к рациону вызывает увеличение длины ворсинок, глубины крипт, увеличение поверхности кишечного мукозного
слоя, в котором идут процессы всасывания, возможно, в результате выделения бутирата, влияющего на мукозные клетки (Kleessen et al ., 2003). Кроме того, предположено, что усиление всасывания кальция в толстом кишечнике при приеме пребиотиков связано с увеличением синтеза

мукозных пептидов, связывающих кальций (Ohtaet al ., 1998).


Биологической активностью обладают метаболитные пробиотики – препараты, которые содер-

жат не только клетки пробиотических микроорганизмов, но и продукты их жизнедеятельности. Например, препарат Споробакт, содержащийспоры двух штаммов  B. subtilis , клетки бацилл и

их метаболиты, улучшает усвоение питательных веществ корма, что ведет к снижению затрат

комбикорма на получение дополнительного прироста живой массы, повышает продуктивность животных (Михалюк и др., 2013; Сверчкова и др., 2013).


В опыте на фистульных бычках выявлено действие на микробиоценоз рубца пробиотика на основе  B. Subtilis В-8130 с комплексом метаболитов (продуктов твердофазного культивирования

бациллы на свекловичном жоме). Исследования методом T-RFLP-анализа состава микробного
сообщества показали, что введение с кормами в желудочно-кишечный тракт животных клеток
B. Subtilis В-8130 вызвало изменения, подтверждающие влияние пробиотиков на симбионтное
пищеварение (Ушакова и др., 2013б). У контрольных животных доминировали бактерии филума
Firmicutes (55.11  ± 1.97%), главным образом класса Clostridia (53.10  ± 2.06%) с основной долей

семейств Lachnospiraceae (25.93  ± 1.41%) и Clostridiaceae (9.9  ± 1.35%). Примерно в равных

количествах присутствовали члены филума Bacteroidetes (11.15  ± 2.88%) и филума Actinobacte-

ria (9.27  ± ± 1.95%). Доля некультивируемых форм составила 17.28  ± 2.01%. Содержание бацилл

сем. Bacillaceae было <2% (1.46  ± 0.41%). Выявленный состав микробного сообщества в рубце бычков характеризовал процессы пищеварения в этом отделе желудочно?кишечного тракта, ко-

торые соответствовали физиологическому состоянию молодых животных, перешедших с молочной на растительную диету: расщепление клетчатки и крахмала кормов связано с массовым развитием бактерий сем. Lachnospiraceae, филума Bacteroidetes ,  сем. Ruminococcaceae , сем. Тhermoanaerobacteriaceae, обладающих целлюлолитической и амилолитической активностями.

 

Ферментация сложных и простых углеводов была обеспечена также совокупной жизнедеятель-ностью представителей семейств Clostridiaceae , Eubacteriaceae ,  Veillonellaceae и других при-сутствующих в рубце бактерий (Dehority, Grubb, 1981). Попадание в рубец опытных животных

клеток  B. subtilis вызвало незначительное увеличение доли Bacillaceae (до 2.8  ± ± 0.3%).

Однако на порядок выросла численность Thermoanaerobacteriaceae ,  Peptostreptococcaceae,
Alicyclobacillaceae. В 2 раза увеличилась численность Pseudomonadaceae ,  Burkholderiaceae,
некультивируемых Bacteroidetes . В целом повысились показатели эффективности пищеварения:
увеличилось на 35% общее количество рубцовых бактерий и простейших (численность бактерий
увеличилась на 30%, простейших – на 40%), на 10.7% вырос синтез летучих жирных кислот. Изу-
чение корреляционных связей представителей рубцового микробного сообщества с пищеваре-
нием, ростом и развитием животных выявило избирательную стимуляцию введенными бацилла-
ми тех групп и отдельных представителей, которые  имели  положительные  коэффициенты кор- реляции с обсуждаемыми процессами. Произошла направленная перестройка микробной эко-системы рубца в сторону повышения положительного влияния на пищеварение и продуктивность хозяина.