Новое поколение пробиотических препаратов кормового назначения

Журнал «Фундаментальные исследования» №1 2012 год, 184-192

Ушакова Н. А. 1, Некрасов Р. В. 2, Правдин В. Г. 3, Кравцова Л. З. 3, Бобровская О. И. 2, Павлов Д. С. 1
1. Институт проблем экологии и эволюции животных им. А.Н. Северцова РАН, Москва
2. ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, Дубровицы
3. ООО НТЦ БИО, Шебекино

Развитие фундаментальных исследований симбиотических взаимодействий организма и его микробиоты получило новое направление в связи с появлением представлений о существовании бактерий в виде биопленок, что определило уточнение роли пробиотиков и особенно — кормового назначения. Кормовые пробиотические препараты находят широкое применение в практике животноводства, позволяют усовершенствовать существующие системы разведения и кормления сельскохозяйственных животных, становятся важным компонентом современного рационального кормления животных [21].

Цель настоящего обзора литературы состоит в рассмотрении данных, касающихся биологической эффективности нового поколения кормовых пробиотиков, механизмов их действия, а также возможностей использования результатов этих исследований в практике животноводства. Обсуждаются литературные сведения и собственные результаты, позволяющие предложить подходы к увеличению рентабельности животноводческого производства.

Современная концепция пробиотиков.

Пробиотики — живые микробные добавки, которые оказывают благоприятное действие на организм человека и животного путем улучшения кишечного микробного баланса [46], стимулируют обменные и иммунные процессы [28]. Это объекты всесторонних научных исследований и важный товар на мировом рынке, объем продаж которых оценивается в миллиарды долларов в год. Широкому кругу потребителей доступны сотни пробиотических продуктов питания и пищевых добавок, а производители кормов для сельскохозяйственных и домашних животных, птицы и рыбы используют пробиотические препараты в составе кормов. Применение пробиотиков связано с решением различных проблем со здоровьем, повышением эффективности пищеварения, стимуляцией роста и развития. Пробиотики перспективны в качестве профилактических средств и сопутствующей терапии, но не являются основным средством для лечения заболеваний. На специальном коллоквиуме Американской Академии Микробиологии в ноябре 2005 г. обсуждались вопросы взаимосвязи между микроорганизмами, иммунитетом и болезнями, доказательные данные в отношении лечебных свойств пробиотиков и возможные перспективы их использования [56]. Установлено, что применение пробиотиков может оказывать противоинфекционное, иммунномодуляторное воздействие на организм, повышать барьерные функции (физиологические механизмы, защищающие организм от воздействия окружающей среды, препятствующие проникновению в него бактерий, вирусов и вредных веществ), стимулировать моторику и экскреторную функции кишечника.

Введенные с препаратами пробиотические штаммы взаимодействуют с сообществом бактерий кишечника, выделяют метаболиты, влияющие на активность иммунной, гормональной, пищеварительной систем организма-хозяина.
В последнее десятилетие концепция пробиотиков претерпела существенные изменения. Возросло внимание исследователей к структурным компонентам и продуктам метаболизма пробиотических микроорганизмов. Данные изменения связаны с расширением представлений о биологической эффективности пробиотиков и обнаружении того факта, что структурные элементы клеток и их метаболиты в ряде случаев оказываются не менее эффективными [37]. Выделяют 4 поколения пробиотиков [38] (табл. 1).

Таблица 1

Современные поколения пробиотиков

I поколение Монокомпонентные препараты, содержащие один штамм бактерий
II поколение Самоэлиминирующиеся антагонисты, к которым относятся представители рода Bacillus, главным образом, В.subtilis, B.licheniformis
III поколение Комбинированные препараты, состоящие из нескольких штаммов бактерий (поликомпонентные) или включающие добавки, усиливающие их действие
IV поколение Иммобилизованные на сорбенте (сорбированные) живые бакте


В настоящее время на рынке пробиотиков востребованы комбинированные препараты. Входящие в комплексный пробиотик штаммы бактерий объединяются по способности штаммов продуцировать различные ферменты, биологически активные вещества так, чтобы они дополняли друг друга по биологической активности. Кроме того, для получения новых поликомпонентных биологически активных препаратов комбинируют комплексы пробиотиков с пребиотическими веществами.

К прогрессивным формам препаратов нового поколения относятся сорбированные формы пробиотиков. Сорбированные пробиотики содержат бактерии, иммобилизованные на частицах твердого сорбента. За счет химических и электростатических сил взаимодействие таких форм со стенкой кишечника выше. Сорбент ускоряет дезинтоксикацию и репаративный процесс. Наиболее часто использующиеся природные сорбенты — угли, цеолиты и кремнеземы. Они обладают относительно хорошей сорбционной и ионообменной способностью, имеют сильно развитый поверхностный каркас, с порами разного диаметра, способными взаимодействовать с различными веществами и клетками пробиотика. Биологическая активность таких препаратов связана с тем, что микробная масса живых пробиотических бактерий иммобилизована на сорбенте, благодаря чему они лучше выживают и быстрее заселяют кишечник [15, 36]. Иммобилизованная форма пробиотического препарата позволяет существенно повысить защиту бифидо- и лактобактерий при прохождении через желудок, где обычные препараты, содержащие лиофильно высушенные клетки пробиотиков, теряют более 90 % активности. Композиции цеолиты + пробиотик обладают выраженными иммунокоррегирующими свойствами [12], нормализуют микробиоценоз желудочно-кишечного тракта, повышают неспецифическую резистентность организма, стимулируют функциональную деятельность пищеварительной системы, обладают, как правило, детоксикационными свойствами. Биологическая эффективность сорбированных пробиотиков позволяет применять уменьшенные дозы бактерий. В частности, одна доза Бифидумбактерин форте (пробиотик, сорбированный на косточковом активированном угле) содержит не менее 107 КОЕ/г бифидобактерий (количество колониеобразующих клеток бактерий (КОЕ) — указано в инструкции по применению), что сравнимо с содержанием бактерий в кисломолочных продуктах, и на два порядка меньше дозы, рекомендованной для обычных пробиотиков. Адсорбированные на нейтральном фито-носителе клетки пробиотических микроорганизмов содержатся в препаратах кормового назначения Целлобактерин и Целлобактерин-Т [13, 29], доза ввода которых в корма составляет 1 кг на тонну комбикорма. Учитывая, что в 1 т комбикорма с Целлобактерином Т содержится 104 КОЕ пробиотика [22], это составляет 107 КОЕ на 1 кг препарата.

В качестве сорбента эффективно использование пребиотиков. Пребиотики — это класс препаратов для регуляции кишечной микрофлоры, который приобретает все большую популярность. Пребиотики — субстраты, стимулирующие естественную микрофлору, не перевариваются и не всасываются в желудке и тонком отделе кишечника. Попадая в толстый отдел кишечника, пребиотики используются в качестве питательной среды для нормальной микробиоты [41, 43, 51]. У млекопитающих в первые дни после рождения основным пребиотическим субстратом является лактулоза, входящая в состав молока. С переходом на смешанное кормление субстратом, способствующим росту нормальной микробиоты, становятся структурные элементы растительных тканей, различные полисахариды (пектины, инулин и др.). Для разных видов животных предложен пробиотический препарат Зоонорм, который состоит из лиофилизированной микробной массы живых бактерий Bifidibacterium bifidum в виде микроколоний, сорбированных на частицах активированного угля и лактулозы [31].

Научное обоснование конструирования пробиотических препаратов основано на анализе взаимоотношений макро- и микроорганизма. В настоящее время активно развивается представление о кишечной микробиоте как о самостоятельном «органе», который в виде биопленки покрывает стенку кишечника [5, 19, 26, 27, 42, 44]. Сложившаяся в ходе развития организма биопленка — прочная система, препятствующая внедрению чужеродных штаммов. Коллективный иммунитет биопленки кишечника не позволяет в полной мере осуществлять коррекцию дисбактериозов с помощью препаратов живых культур пробиотиков — бифидобактерий, лактобацилл, энтеробактерий, поскольку промышленные штаммы микроорганизмов вследствие биологической несовместимости не могут войти компонентом в биопленку, и пополняют пул транзиторных бактерий. Тем не менее, пробиотические препараты применять следует. В содержимом кишечника присутствуют различные симбионты и паразиты — транзиторные бактерии, простейшие, гельминты, роль которых в нормальном функционировании животного организма нельзя недооценивать. Введенные с препаратами пробиотические штаммы, выделяя биологически активные метаболиты, сигнальные вещества, антибиотики, бактериоцины, вступают во взаимодействие с кишечной микрофлорой и оказывают воздействие на функционирование различных физиологических систем организма-хозяина.

Пробиотические препараты кормового назначения.

Современная интенсивная индустрия животноводства, птицеводства и рыбоводства основывается на использовании в качестве обязательных компонентов комбикормов различных биологически активных стимуляторов обмена веществ, пищеварения, иммунитета животных. Для повышения перевариваемости и усвояемости кормов, стимуляции роста и развития животных, повышения неспецифического иммунитета применяются ферментные, пробиотические, пребиотические и комбинированные ферментно-пробиотические препараты, а также комплексные пробиотические препараты, обогащенные фитокомпонентами [8-11, 18, 25, 30, 39, 40, 47, 52, 53, 57]. Пробиотики положительно влияют на организм хозяина, способствуют восстановлению пищеварения, биологического статуса, иммунного ответа, повышают эффективность вакцинаций. Применение пробиотиков существенно уменьшает расходы на лечение заболеваний у животных, повышает продуктивность последних и улучшает качество продукции.

Аспекты использования пробиотиков затрагивают широкий круг проблем, связанных с коррекцией кишечного биоценоза, иммунной, гормональной и ферментной систем молодняка и взрослых животных. Кроме того, использование пробиотиков имеет актуальное значение не только для животноводства, но и для здравоохранения в целях: снижения риска заболеваемости людей и повышения экологической безопасности сельскохозяйственной продукции.

Несмотря на тот факт, что полезные свойства нормальной кишечной микробиоты известны уже более 100 лет, учение о пробиотиках только развивается, и история его становления охватывает не более чем 25-летний период, когда стало известно, что нормальная кишечная микрофлора участвует в поддержании колонизационной резистентности слизистой кишечника и играет немаловажную роль в предупреждении заболеваний человека и животных. Неинфекционные желудочно-кишечные заболевания молодняка животных и птицы распространены повсеместно, развиваются с первых часов жизни животного, сопровождаются тяжелыми токсическими явлениями, характеризуются высокой смертностью, нанося значительный экономический ущерб. Проблема профилактики и лечения желудочно-кишечной патологий у животных и птицы, возбудителями которых являются условно-патогенные кишечные микроорганизмы, имеет не только экономическое, но и социальное значение. Экономические убытки от сальмонелеза в США оцениваются в 2 млрд долларов, в Канаде 300 млн долларов. В странах СНГ за последние 15 лет заболеваемость людей и птицы сальмонелезом возросла в 7 раз, при этом этиологическое значение S.enteridis в заболевании людей возросло на 30 %, у животных и птицы на 75 %, а индикация возбудителя в продуктах питания увеличилась на 50 % [14]. Предотвратить развитие многих патологий у животных позволяет использование кормов, обогащенных биологически активными кормовыми пробиотическими добавками.

Развитие интенсивных форм животноводства, птицеводства, рыбоводства и последовательное повышение их эффективности требуют решения как технических проблем, так и вопросов кормления и использования полноценных и экономически выгодных кормов для всех видов разводимых животных. Важнейшей задачей является создание и применение в практике таких кормовых смесей, которые бы максимально усваивались организмом для обеспечения его жизненных функций и обладали профилактическими свойствами [3]. Пробиотики считаются эффективным элементом технологии производства безопасной продукции животноводства и птицеводства [16].

Пробиотики кормового назначения рассматриваются ведущими специалистами как «...часть рационального потенциала животных, поддержания их здоровья и получения продукции высокого качества, безопасной как в бактериальном, так и в химическом отношении» [21].

Получение пробиотических препаратов в виде биопленки — новое направление биотехнологии.

В настоящее время существует широкий спектр пробиотических препаратов, предназначенных для коррекции кишечного биоценоза, повышения неспецифического иммунитета молодняка, стимуляции откорма, молочной продуктивности, яйценоскости. В Российской Федерации на 2006 год зарегистрировано около 80 наименований отечественных и импортных пробиотических препаратов [21]. Предлагаемые на рынке пробиотические препараты различаются не только по стоимости, но и по составу, качеству, способам и дозам применения.

Определяющим фактором эффективности пробиотиков во многом являются технологии получения этих препаратов. Современный подход к разработке пробиотических препаратов подразумевает, во-первых, применение различных видов микроорганизмов в определенных сочетаниях, во-вторых, выпуск их в форме, допускающей длительное хранение при обычной температуре, и в-третьих, не теряющих своих свойств при внесении их в процессе производства комбикормов и кормовых добавок. Клинико-экспериментальные исследования показали, что под действием желудочного сока и желчи пробиотики теряют почти 90 % своей активности к моменту попадания в кишечник. Разрабатываются различные способы повышения выживаемости бактерий, например, за счет их иммобилизации на пористых микроносителях, включения в состав препарата компонентов питательной среды. Однако даже в случае научного обоснования пробиотических препаратов, далеко не все из них оказываются эффективными на практике [35].

Поиск микроорганизмов, которые можно использовать в качестве пробиотиков, представляет собой основу для разработки пробиотических препаратов. Препараты с использованием лактобацилл и бифидобактерий хорошо известны положительным влиянием в поддержании микробного баланса кишечника [49, 50]. В последние годы установлено, что не менее важны в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта животных и некоторые транзиторные бактерии, например, рода Bacillus, которые применяются во многих кормовых пробиотических препаратах, реально оказывая положительное влияние на здоровье и продуктивность животного [1, 2, 7, 23]. Оценивая перспективы использования бактерий рода Bacillus для создания биопрепаратов, можно отметить следующие их преимущества перед другими представителями экзогенной микрофлоры: безвредность подавляющего большинства представителей рода для макроорганизма даже в высоких концентрациях; способность повышать неспецифическую резистентность организма хозяина; антагонистическую активность к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; высокую ферментативную активность; устойчивость к литическим ферментам и обусловленную этим высокую жизнеспособность на протяжении всего желудочно-кишечного тракта; технологичность в производстве; стабильность при хранении; экологическую безопасность. При обсуждении вопросов биологической активности бацилл можно отметить их способность выделять в культуральную жидкость сигнальные молекулы, иммуноактивные протеины [55] и биологически активные пептиды, в число которых входят не только пептидные антибиотики, но и гормоноподобные вещества. В экстрактах клеток и культуральной жидкости Bacillus subtilis показано присутствие соматостатин-подобных пептидов [34]. Ранее было обнаружено, что некоторые синтетические аналоги гормона соматостатина выступают опосредованными антагонистами по отношению к этому гормону, поскольку вызывают аутоиммунную нейтрализацию эндогенного соматостатина, в результате чего снижается его ингибирующее действие на гормон роста, инсулин и гастрин, и появляется ростостимулирующий эффект [45, 53]. Исследования показали, что пробиотические добавки на основе спорообразующих бактерий существенно улучшают переваримость корма у свиней. Результаты опытов подтверждают, что поросята, имеющие микробиоту, сбалансированную в результате применения термически стабильных пробиотиков, имеют лучшую конверсию корма и более высокие приросты живой массы [7].

Особенности физиологии и рационов сельскохозяйственных животных учтены в рецептуре биологически активного пробиотического препарата Ферм-КМ. Технология получения препарата включает неполное сбраживание свекловичного жома пробиотической ассоциацией; конечный продукт состоит из биомассы пробиотиков, продуктов их метаболизма, продуктов биотрансформации фитосубстрата и фитокомпонентов. В состав бактериальной композиции препарата Ферм-КМ включены живые клетки трех штаммов Bacillus subtillis, Bacillus licheniformis, а также комплекс молочнокислых бактерий. Оптимальной является композиция депонированных в ВКПМ штаммов: Bacillus subtillis В-8130, Bacillus subtillis 188, Bacillus subtillis 44-р, Bacillus licheniformis МС-12, демонстрирующих пробиотический эффект в сочетании с эндоглюканазной, протеолитической, и амилазной активностями. В препарате содержится набор важнейших ферментов: целлюлаза, эндоглюканаза, амилаза, комплекс протеаз, липаза, органические кислоты, биологически активные вещества, витамины и аминокислоты, иммуноактивные пептиды — продукты метаболизма пробиотиков. В препарат входят фиточастицы, являющиеся клетчатковым микросорбентом, пребиотики — пектины свеклы [33]. Ферм-КМ — это уникальный препарат, содержащий не только комплекс специально подобранных микроорганизмов, но также биотрансформированный фитосорбент и продукты твердофазного сбраживания растительного субстрата (в том числе, иммуноактивные пептиды [34], стимулирующие неспецифический иммунитет и процессы пищеварения). Пробиотические бактерии отличаются повышенной жизнеспособностью и устойчивостью к неблагоприятным условиям окружающей среды, поскольку находятся в виде биопленки на фитоносителе (рисунок).

Сброженный свекловичный жом с биопленкой бактерий B. subtilis В-8130. Вегетативные клетки бациллы на фитоносителе отмечены стрелками. Сканирующая электронная микроскопия, 10000×

Как уже отмечено выше, биологическая эффективность пробиотических препаратов определяется не только свойствами используемых штаммов микроорганизмов, но также технологией их получения. Новое перспективное направление, используемое в технологии производства препарата Ферм-КМ — получение биологически активной кормовой добавки, содержащей биопленку пробиотических бактерий на поверхности фитосубстрата, что позволяет микроорганизмам сохранять жизнеспособность при высушивании, при гранулировании комбикормов и выживать при комбинировании с некоторыми кормовыми антибиотиками. Исследования показали, что в биопленке по-иному, в сравнении с чистыми культурами бактерий, происходят их физиологические процессы, в том числе продукция метаболитов и биологически активных веществ [4, 19]. Особое значение имеют сигнальные вещества, обеспечивающие взаимодействие клеток в биопленке. По-видимому, такие вещества могут служить аналогами регуляторных молекул животного организма. Можно предположить, что соматостатин-подобный пептид, обнаруженный при развитии некоторых штаммов Bacillus subtilis, является фактором межклеточной коммуникации. Известно, что грамположительные бактерии осуществляют коммуникации, используя олигопептидные сигнальные молекулы [6]. Согласно симбиогенетической теории происхождения эукариот многие сигнальные молекулы, общие для бактерий и эукариот, у первых выполняли синэкологические функции (обеспечение взаимодействия клетки с другими членами прокариотного сообщества), а у вторых стали обеспечивать согласованную работу клеток многоклеточного организма [17]. Поэтому препараты, основанные на твердофазных процессах и получении биопленки пробиотиков, отличаются от препаратов-аналогов наличием сигнальных веществ бактериального происхождения, влияющих на гомеостаз многоклеточных организмов-хозяев. Получение пробиотических препаратов в виде биопленки — новое направление биотехнологии.

Препарат разработан специалистами ООО «НТЦ БИО» совместно с Институтом проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН [32]. ДБА Ферм-КМ позволяет на 50-70 % уменьшить применение распространенных импортных ферментных препаратов и антибиотиков, применяемых для лечения заболеваний ЖКТ. Ферм КМ отличается невысокой стоимостью и полностью ориентирован на зерновую специфику российских комбикормов. Препарат обеспечивает высокоэффективное использование имеющихся кормов, увеличивает конверсию корма, прирост живой массы, значительно улучшает переваривание животными, птицей и рыбами некрахмалистых полисахаридов из различных видов зерна, повышает резистентность организма к неблагоприятным факторам [20, 24]. Испытания препарата в ПФ «Приосколье» показали, что применение Ферм-КМ повышает сохранность цыплят-бройлеров на 0,7 %, увеличивает суточный привес живой массы тела на 2,6 %, увеличивает конверсию корма на 3 %. Влияние Ферм-КМ на яйценоскость продемонстрировано в птицекомплексе ЗАО «Реал-Инвест»; при этом отмечено, что одним из главных критериев улучшения производственных показателей было не только увеличение общего количества товарного яйца (табл. 2), но и его качество. Количество некондиционного яйца сократилось с 3500 до 430 штук в день. Куры-несушки стали вести себя более спокойно и почти не реагировали на присутствие людей (более 3-х человек). Патологоанатомическое вскрытие показало, что уже после 14 дней приема препарата с кормом полностью отсутствовали признаки катарального и геморрагического воспаления тонкого отдела кишечника, в 3 раза сократилось выпадение яйцеводов кур, сами яйцеводы были чистого белого цвета, что свидетельствует о положительном действии препарата Ферм-КМ на продуктивность птицы. Опыт проведен на 73000 несушек кросса Хайсекс коричневый в возрасте на старте - 329 дней (т.е. вторая фаза продуктивности).

Проведенная в условиях физиологического двора ГНУ ВИЖа и ООО «Вёрдазернопродукт» Рязанской области на доращиваемых поросятах-аналогах серия лабораторных и научно-хозяйственных опытов выявила перспективность применения Ферм-КМ в практике кормления свиней. Для определения приростов живой массы (абсолютного, среднесуточного) проводили ежедекадное индивидуальное взвешивание животных. Полученные в опыте материалы были обработаны биометрически с использованием t-критерия Стьюдента. Некоторые результаты представлены в табл. 3. Выявлено, что на фоне достоверного увеличения интенсивности роста поросят, выращиваемых с 36- до 75-дневного возраста, при включении в состав комбикорма ферментно-пробиотического препарата Ферм-КМ, были снижены затраты кормов и энергии на единицу прироста (на 4,9 % по сравнению с контролем). Включение в комбикорма Ферм-КМ обеспечило благоприятные кормовые условия для получения более высоких показателей продуктивности поросят за счет улучшения конверсии питательных веществ корма в прирост живой массы.

Таблица 2


Производственные показатели в опыте с Ферм-КМ в рационе кур-несушек

Показатель Контроль Опыт
«+», «-» к контролю
Октябрь 2010
г.
Ноябрь 2010
г.
Декабрь 2010
г.
Январь 2011
г.
Февраль 2011
г.
Март 2010
г.
Апрель 2011
г.
Октябрь
2010
г.
Продуктивность (яйценоскость), % 56,0 82 79 79 78 77 77  +21
Расход корма, г/гол 124 117 114 115 114 116 116 8
Сохранность, %
за месяц
3,3 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -2,7
Однородность стада, % 72 74 76 76 76 77 78 +6


Достоверно при: * - р ≤ 0,05.

Динамика роста подопытных поросят (M ± m, n = 75)

Показатель
Группа
контрольная
опытная
-
Ферм-КМ
Дни опыта 39 39
Сохранность поголовья, % 94,7 96,0
Живая масса в начале опыта, кг 9,4 ± 0,07 9,4 ± 0,10
Живая масса в конце опыта, кг 26,1 ± 0,24 27,5 ± 0,31*
Общий прирост живой массы, кг 16,7 ± 0,26 18,1 ± 0,31*
Среднесуточный прирост, г 428,2 ± 6,77 464,1 ± 8,01*
То же в % к контролю 100,0 108,4
Затраты комбикорма на 1 кг прироста, кг 1,63 1,55
То же в % к контролю 100,0 94,9

Достоверно при: * - р ≤ 0,05.

Выводы:
Новое поколение кормовых пробиотических препаратов в виде биопленки на фито-носителе отличается высокой биологической активностью и перспективно для применения в рационах животных. Затраты, связанные с приобретением препаратов и их использованием, окупаются дополнительным приростом живой массы, лучшей сохранностью поголовья, лучшей конверсией корма, получением экологически чистой продукции животноводства.
При финансовой поддержке Минобрнауки РФ, ГК № 16.М04.11.0012.

Рецензенты:
Нетрусов А. И., д.б.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии Биологического факультета МГУ им. В. М. Ломоносова, г. Москва;
Пономарев С. В., д.б.н.,, профессор, зав. кафедрой «Аквакультура и водные биоресурсы» ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет», г. Астрахань.